تخلیص پروتئین نوترکیب pepاز باکتریe.coli

در این دهه که دوران تحقیقات در زمینه پساژنومی است و اگرچه اغلب بانک های ژنومی مملو از اطلاعات ژنتیکی موجودات مختلف است هنوز عملکرد و محصولات اغلب ژن ها ناشناخته است. امروزه دانش پروتئومیکس پیشرفت شگرفی در زمینه مطالعه فعالیت محصولات ژنی داشته و بعنوان ابزاری توانمند در عرصه درک و شناخت عملکرد ژن ها مدنظر قرار گرفته است. هدف از این بررسی بهینه سازی شرایط لازم جهت تولید پروتئین نوترکیب پراکسیزومی موشی (pep) در گونه مناسب و مستعد شده از کلی باسیل به نام bl21 میباشد. پروتئین نوترکیب pepدر مراحل بعد خالص شده و بعنوان بخشی از مطالعات پروتئومیکسی جهت شناسایی اجزاء سلولی واکنش دهنده با آن به کار خواهد رفت. در این بررسی وکتور بیان شونده در اشرشیاکلی pgex6p2) ( که در آن ژن pep در مجاورت ژن gst (گلوتاتیون-s- ترانسفراز ) دست ورزی و قرار داده شده است به کارگرفته شد. وکتورهای نوترکیب به درون سلول های bl21 که سلول های باکتریائی مناسب جهت بیان پروتئین نوترکیب میباشند، ترانسفورم شدند. سلول های باکتریائی بطور مجزا gst و پروتئین نوترکیب متصل به gst را تحت رقت 2000 برابر در محیط 2yt بیان کردند.بعد از 3 ساعت کشت در دمای °c37 ، ایزوپروپیل تیوگالاکتوزیداز (iptg) در غلظت های مختلف به محیط کشت اضافه شد. در گام بعدی کشت باکتری ها در دماهای مختلف تا رسیدن به میزان رشد مناسب بررسی شد. در نهایت مجددأ سلول ها در 600µl ازمحلول تریس بافری ) 7.5 :ph ( tris-hcl حاوی محلول 1میلی مولار فنیل متیل سولفونیل فلوراید (pmsf) ، در حضور غلظت های مختلف triton x-100 یا np40 سوسپانسیونه شدند و سپس سونیکیت شدند. عملکرد سونیکیشن با توان و پروب های مختلف اولتراسوند صورت گرفت. لیزات سلولی سانتریفیوژ شده و سوپرناتانت حاصله جمع آوری وبا µl15 ازسوسپانسیون %50 گلوتاتیون سفاروزدر °c4 برای 3 ساعت انکوبه شدند. ذرات گلوتاتیون سفاروز 3 بار با بافر شستشو و در آن مجددأ سوسپانسیونه شده ودر الکتروفورز sds-page بکار گرفته شدند. جهت تشخیص و شناسایی باندهای پروتئینی ژل ها با رنگ کوماسی برلیانت (cbb) رنگ آمیزی شدند. بهینه ترین حالت برای بیان ژن و تولید پروتئین نوترکیب pep در غلظت µgr/ml 0.1 از iptg در کشت شبانه باکتری بدست آمد. ما هیچ تفاوت معنا داری در بکارگیریtritonx100 یا np40 بعنوان شوینده های حلال گر مشاهده نکردیم، هر جند که بهترین غلظت برای هر دو شوینده (v/v) %1/0 مشخص شد. بعلاوه مناسب ترین شرایط سونیکاسیون جهت تخریب بقایای دیواره سلولی باکتری 340 پالس در 5 دقیقه با شدت %60 در هر cycle به دست آمد.